DOLOČANJE OPTIMALNEGA ČASA
ZA PARITEV PRI PSICI 

Maja Brložnik, dr. Pavo Zaninović
Prva - K, Klinika za male živali, Gorkičeva 6, Ljubljana. Določanje optimalnega časa za paritev pri psici. 6. podiplomsko izpopolnjevanje veterinarske zbornice, Ljubljana 2010.

Ključne besede: estrus, ovulacija, vaginoskopija, vaginalna citologija, progesteron.

Izvleček

V prispevku je podan prikaz fizioloških in vedenjskih sprememb, ki se pojavijo med pojatvenim ciklusom psičke ter uporaba hormonske, citološke in vaginoskopske preizkave za določanje ovulacije in primernega načrta parjenja.

Key words: estrus, ovulation, vaginoscopy, vaginal cytology, progesterone.

Abstract

The article is a review of the physiological changes that occur throughout the estrous cycle of the bitch. The discussion deals with the application of hormonal, behavioural, cytologic and vaginoscopic profiling as an aid for ovulation timing and proper breeding management.

UVOD

Potreba po določanju časa ovulacije se pojavi predvsem v primerih neplodnosti, slabše dostopnosti samca ali zmanjšane življenjske dobe semena pri umetnem osemenjevanju z ohlajenim ali zmrznjenim semenom.
Za določanje obdobij ciklusa pri psički obstajajo različne diagnostične metode. Z njimi ocenjujemo vedenjske, klinične, hormonske in citološke značilnosti obdobij ciklusa. Hormona progesteron in estrogen vplivata na procese proliferacije, maturacije in eksfoliacije sluznice vagine, kar lahko spremljamo z vaginoskopskim pregledom in vaginalno citologijo.
Plodno obdobje je čas, v katerem lahko pride do oploditve. Semenčeca  preživijo v rodilih 5 do 6 dni, zato lahko pride do uspešne paritve 2 dni pred LH valom in 6 dni po njem.
Za določanje optimalnega časa za paritev zadostujejo ocena obnašanja živali ter citološki, hormonski in vaginoskopski izvid. Metode kot so ultrazvočni pregled jajčnikov in vrednotenje cervikalne sluzi (električni upor oziroma prevodnost, koncentracija glukoze in mikroskopsko ocenjevanje kristalizacije sluzi), imajo za določanje optimalnega časa parjenja zelo majhno klinično uporabnost.

POJATVENI CIKLUS

Nastop prve gonitve, dolžina pojatvenega ciklusa in dolžina interestrusnih obdobij se razlikuje med različnimi pasmami in individualnimi psičkami. Prva gonitev nastopi med 6 in 18 mesecem starosti, ko psička doseže pričakovano velikost in težo. Psička je monoestrusna (en estrus na pojatveni ciklus) in nesezonska (estrus se lahko pojavi v kateremkoli obdobju leta). Ker obstajata dva splošna vrha pojatvene aktivnosti (pozno pozimi in spomladi), jo lahko uvrščamo med marginalno sezonske vrste.
Povprečno trajanje interestrusnega intervala je 7 mesecev, je pa to obdobje različno med psičkami znotraj iste pasme in med pasmami. Pojatveni ciklus delimo v 4 obdobja različnih dolžin (proestrus, estrus, diestrus in anestrus). Pojatev (gonitev) zajema proestrus, v katerem je psica  zanimiva za samce in estrus, ko je godna. Ciklus se nadaljuje z diestrusom, ko pride po proliferaciji do involucije maternice in anestrusom, ki je obdobje mirovanja.
Proestrus
Začetek proestrusa označujeta nabreklost vulve in krvav izcedek iz nožnice. Prvi dan krvavitve označuje prvi dan gonitve. Jakost krvavitve je različna, zato jo včasih spregledamo. Proestrus lahko traja od 1 do 21 dni, najpogosteje 6 do 11 dni. V tem obdobju psička privlači samce, vendar še ni godna za paritev. Proestrus je čas, ko se pod vplivom naraščajočega estrogena, reprodukcijski trakt pripravlja na paritev in brejost. Estrogen povzroča maturacijo, proliferacijo in eksfoliacijo celic nožnične sluznice ter proliferacijo in hiperemijo sluznice maternice. Nivo progesterona je v proestrusu nizek in začne naraščati nekaj dni pred estrusom.
Estrus
Pri večini psic traja estrus 5 do 10 dni. Vedenjski estrus je obdobje, ko je psička godna (dopušča parjenje) in je posledica spreminjanja koncentracij hormonov, vendar se ne ujema vedno s hormonskim estrusom in se lahko začne tudi 3 dni pred ovulacijo ali 5 dni po ovulaciji. Hormonski estrus se začne z LH valom (dvigom luteinizirajočega hormona). Temu sledi dvig FSH (folikle stimulirajočega hormona) in naraščanje koncentracije progesterona. V vaginalnem brisu zasledimo predvsem superficialne celice, od katerih je večina keratiniziranih. Maturacija in keratinizacija celic sta posledica še vedno visoke koncentracije estrogena, ki pa začne v estrusu padati, zato eritrociti izginevajo. Do ovulacije pride približno 2 dni po LH valu. Po ovulaciji se oblikujejo rumena telesa, ki izločajo progesteron. V nasprotju z drugimi sesalci ovulirajo psičke nezrele oocite in oploditev se zgodi šele 2 do 4 dni po ovulaciji, ko pride do prve mejoze in nastanejo sekundarni oociti. Po maturaciji so jajčeca sposobna oploditve 1 dan.
Diestrus
Diestrus je zadnje obdobje pojatvenega ciklusa, začne se približno 7 do 9 dni po LH valu. To je obdobje, ko psička ne dopušča več parjenja. Koncentracija progesterona še naprej raste  in pospešuje proliferacijo vaginalne sluznice, zato najdemo v brisu številne celice, med katerimi prevladujejo intermediarne celice. Na koncu diestrusa pade raven progesterona na osnovno vrednost.
Anestrus
Anestrus je obdobje spolnega mirovanja. Nivo hormonov je nizek, v vaginalnem brisu najdemo maloštevilne celice iz spodnjih plasti.

UGOTAVLJANJE OPTIMALNEGA ČASA ZA PARITEV

Natančna časovna opredelitev plodnega obdobja je možna z upoštevanjem zunanjih znakov, koncentracije progesterona ter makroskopskih in citoloških sprememb na vagini.

ZUNANJI ZNAKI POJATVE

V proestrusu psička privlači samce. Zaradi dviga koncentracije estrogena je zunanje spolovilo edematozno, vulva in perinealna tkiva se povečajo in nabreknejo. Pojavi se krvav gonitveni izcedek.
V estrusu se zaradi padca koncentracije estrogena in dvigovanja koncentracije progesterona zmanjša edem, zato pride do mehčanja vulve in perineuma. Takrat je psička godna za paritev, kar kaže z upogibanjem hrbta, odmikanjem repa in značilno stojo zadnjih nog.
Mehčanje vulve in godnost psičke lahko nastopi 1 do 2 dni pred ovulacijo ali šele 3 do 5 dni po ovulaciji, zato se na zunanje znake pojatve ne moremo povsem zanesti.
MAKROSKOPSKE SPREMEMBE VAGINALNE SLUZNICE

Spremembe v izgledu vaginalne sluznice lahko ocenjujemo z uporabo rigidnega ali fleksibilnega endoskopa. V praksi se uporablja rektoskop ali otoskop z daljšim tubusom.
Ocenjujemo gubanje in barvo sluznice ter prisotnost tekočin. Med anestrusom je vaginalna sluznica relativno ravna, suha in rdeča. Tanko, nežno in krhko sluznico lahko med manipulacijo poškodujemo.
Na začetku proestrusa se sluznične gube povečajo, so edematozne, sluznica je gladka, svetlikajoča, med gubami je krvav izcedek, ki izhaja iz maternice. Površina sluznice je vedno bolj svetle barve, saj plasti celic skrijejo spodaj ležeče kapilare, ki so vidne med anestrusom in na začetku proestrusa. Na koncu proestrusa in v začetku estrusa (v času LH vala) se začne zaradi upada estrogena krčenje gub (zmanjša se edem), zato izgledajo gube razločno angulirane (t.i. krenulacija gub), so blede barve. Ob nastopu diestrusa se gube izravnajo in postanejo okrogle.

VAGINALNA CITOLOGIJA

Spremembe v celičnem vzorcu vaginalnih brisov so odraz sprememb vaginalnega epitela zaradi delovanja hormonov jajčnika. Na osnovi enega citološkega preparata je težko oceniti fazo ciklusa, priporoča se zaporedno ocenjevanje vaginalnih brisov.
Celice dobimo z uporabo vatenke ali z odtisom vestibularne sluznice. Za rutinsko vaginalno citologijo se priporoča barvanje z barvilom Diff-Quik.

V vaginalnih brisih razlikujemo 4 tipe vaginalnih celic: parabazalne, male in velike intermediarne ter superficialne celice. Razmerje med celicami v brisu odraža vpliv hormonov jajčnika. Celice v vaginalnem brisu izhajajo iz bazalnih celic, ki so pripete na bazalno membrano. Vaginalne celice so razdeljene glede na lokacijo celic v plasteh epitela.
Parabazalne (PB) celice so najmanjše celice, ki jih vidimo v vaginalnih brisih. To so okroglo-ovalne celice, z velikim dobro obarvanim okroglim jedrom in pičlo količino temne citoplazme.
Intermediarne celice so angulirane, večje od parabazalnih, jedra so podobna parabazalnim. Celice iz spodnjih plasti so male intermediarne (MI) celice in imajo temnejšo citoplazmo, so manj angulirane. Zgornje, velike intermediarne  (VI) celice so svetlejše, bolj angulirane, imajo več citoplazme, ki je nagubana.
Superficialne (SP) celice so v vaginalnih brisih največje epitelne celice. Tako kot velike intermediarne celice, imajo veliko citoplazme, so močno angulirane, s piknotičnim jedrom ali brez njega. S starostjo se povečuje stopnja keratohialinizacije, citoplazma se obarva eozinofilno.
V brisih soMetestrusne celice so celice z enim ali več nevtrofilci v citoplazmi, pojavljajo se v metestrusu in so povezane s prisotnostjo levkocitov v vagini.
Penaste celice so celice, ki vsebujejo citoplazmatske vakuole različnih velikosti. Njihov pomen ni znan.

Med anestrusom najdemo v vaginalnem brisu maloštevilne PB in MI celice. Tipična je odsotnost superficialnih celic.
Vaginalni bris zgodnjega proestrusa vsebuje PB celice, MI ter VI celice in levkocite ter eritrocite. Ko proestrus napreduje, je vedno več superficialnih in anuklearnih celic, ki so bolj keratinizirane. Nevtrofilci izginjajo, rdeče celice razpadajo.
V estrusu so najštevilčnejše SP celice, pri nekaterih psičkah je delež nad 70%, pri drugih nad 90%. Celice imajo piknotična jedra ali pa so anuklearne. Preostale celice so VI celice. Estrusni bris ne vsebuje PB in MI celic, ni nevtrofilcev.
Diestrus se začne, ko se delež SP celic nenadno zmanjša na manj kot 30% in se poveča število PB, MI  celic ter levkocitov. V diestrusu najdemo tudi metestrusne in penaste celice.
Citološko vrednotenje sprememb vaginalne sluznice je bilo dolgo časa poglavitni način določanja estrusa. Žal ima diagnostična metoda nekatere slabosti. Citološki estrus se lahko razlikuje od vedenjskega in hormonskega estrusa, interpretacija deleža superficialnih celic je subjektivna, pri nekaterih psičkah maksimalna keratinizacija ne doseže 90% in se lahko pojavi pred ali šele po LH valu. Ne glede na omejitve diagnostične metode za določanje časa plodnega obdobja je ta zelo uporabna, predvsem če vrednotimo zaporedne brise v gonitvenem obdobju in jo interpretiramo v zvezi z drugimi metodami diagnostike.

DOLOČANJE KONCENTRACIJE HORMONOV

V proestrusu narašča koncentracija estrogena in doseže vrh 24 do 48 ur pred LH valom.
LH val označuje začetek estrusa, v katerem je upadanje estrogena različno intenzivno, zato nekatere psičke krvavijo tudi v tem času.  Koncentracija progesterona je pred LH valom nizka, potem pa začne strmo naraščati. Ko preseže delež superficialnih celic 60%, začnemo z merjenjem koncentracije LH in/ali progesterona
Merjenje LH
Merjenje LH koncentracije je zanesljiva metoda določanja optimalnega časa za parjenje, ki pa ima pa nekatere omejitve. LH je potrebno meriti dnevno, zato je metoda draga. Koncentracija LH hormona je v krvi zvišana 16 do 24 ur, zato lahko LH val zgrešimo tudi z dnevnimi merjenji. Če ni dostopen hitri test, je metoda zahtevna in dolgotrajna. LH hormon je vrstno specifičen, zato se ne moremo posluževati merjenj v laboratorijih za ljudi.
Merjenje LH je potrebno pri psičkah, ki niso zanosile v prejšnjih paritvah, kljub primerno izbranim časom paritve z določanjem koncentracije progesterona. Kandidat za LH meritve so tudi psičke z nejasno progesteronsko sliko.
Merjenje progesterona (1 nmol/l = 0.315 ng/ml oz. 1 ng/ml = 3.17 nmol/l)
Obstajajo različne metode merjenj progesterona (hitri testi, v laboratorijih za ljudi...).
Osnovni nivo progesterona je pri psičkah različen. Nekatere imajo pred LH valom vrednosti pod 1 ng/ml, druge 1 do 2.5 ng/ml. Vsekakor pa ostaja koncentracija progesterona pred LH valom nizka. Ovulacija nastopi, ko koncentracija progesterona preseže 4-8 ng/ml.
Koncentracija progesterona strmo raste med in po LH valu, zato je metoda bolj uporabna od meritev LH. Zadostuje merjenje vsaka 2 dni. Paritev načrtujemo 4 do 6 dni po tem, ko koncentracija progesterona preseže osnovni nivo za 1 ng/ml, kar se zgodi med LH valom. Nekateri protokoli predlagajo začetek parjenja dan po tem, ko vrednosti progesterona presežejo 8 do 10 ng/ml. V tabeli spodaj podajamo razlago izvidov koncentracij progesterona.

Tabela 1: Razlaga progesteronske slike

Na sliki spodaj je podan oris nekaterih sprememb, ki se dogajajo v spolnem ciklu.

Slika 1: Oris nekaterih značilnosti pojatvenega ciklusa

Pri določanju optimalnega časa parjenja se ne moremo zanašati samo na eno metodo diagnostike ovulacije. Vaginalna citologija označuje fazo estrusnega cikla, vendar ni zanesljiv indikator LH vala ali ovulacije brez upoštevanja drugih parametrov. Hormonska slika, osnovana na razumevanju estrusnega cikla, omogoča identifikacijo LH vala in časa ovulacije.
Optimalno obdobje za parjenje je 4 do 6 dni po LH valu. Jajčeca so po ovulaciji nezrela (primarni oociti) in so lahko oplojena šele v stadiju sekundarnega oocita, kar je 2-3 dni kasneje (4-5 dni po LH valu). Jajčeca ostanejo plodna največ 4 dni po ovulaciji (6 dni po LH valu). V tem času so jajčeca v spodnji tretjini jajcevodov, kjer pride do oploditve.
Zaporedna parjenja načrtujemo v času po ovulaciji, dokler se oociti smatrajo za fertilne.
Če parimo oziroma semenimo samo enkrat, potem je najprimernejši čas 2 dni po tem, ko je koncentracija progesterona 4-10 ng/mL (približno 2 dni po ovulaciji) oziroma ko je več kot 90% vaginalnih epitelnih celic keratiniziranih (pri nekaterih psičkah le več kot 60%) in doseže vaginalna sluznica maksimalno krenulacijo.

LITERATURA

· Schaeferes-Okkens AC. Estrous Cycle and Breeding Management of the Healthy Bitch.
In: Ettinger SJ, Feldman EC. Textbook of Veterinay Internal Medicine. USA: Elsevier, 2005, 1640-55.

· Feldman EC et Nelson RW. Ovarian Cycle and Vaginal Cytology. In: Canine and Feline Endocrinology and Reproduction. USA: Saunders. Third edition, 2004, 752-91.

· Johnson CA. Disorders of the Estrous Cycle. In: Nelson RW, Cuoto CG. Small Animal I    nternal Medicine, Third edition. USA: Mosby, 1998: 847-58.

· England G et Concannon P.W. Determination of the Optimal Breeding Time in the Bitch: Basic Considerations.  In:  Recent Advances in Small Animal Reproduction, 2002.
http://www.ivis.org/advances/Concannon/england2/chapter_frm.asp?LA=1

· Kampschmidt K. Predicting the Fertile Period. Medical FAQS.
http://www.vin.com/Members/Proceedings/Proceedings.plx?CID=medfaq&PID=pr16192&O=VIN

· Adams AJ. Ovulation Timing in the Bitch (VET-323). In: Proceedings of Western Veterinary Conference 2004.
http://www.vin.com/Members/Proceedings/Proceedings.plx?CID=wvc2004&PID=pr05483&O=VIN

· Teske E. Vaginal Cytology. In: Proceedings of the 34th World Small Animal Veterinary Congress. WSAVA 2009.
http://www.ivis.org/proceedings/wsava/2009/lecture7/5.pdf?LA=1

· Blendinger K. Physiology and pathology of the estrous cycle of the bitch. In: Proceedings of 56° Congresso Internazionale Multisala SCIVAC,  2007.
http://www.ivis.org/proceedings/scivac/2007/blendinger1_en.pdf?LA=6

· Meuten DJ, Raskin RE et Rebar AH. Cytology of Internal Organs. In: Proceedings of the NAVC North American Veterinary Conference, 2005.
http://www.ivis.org/proceedings/navc/2005/SAE/073.pdf?LA=1

· Thrall MA, Olson PN. The Vagina. In: Cowel RL, Tyler RD, Meinkotk JH. Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat, second edition, USA: Mosby 1999: 240-8.